引物设计，pcr引物设计四大原则?

pcr引物设计四大原则?

pcr引物设计应遵循以下原则： ①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。 ②引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。 ③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC*随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

如何利用Primer6.0进行引物的设计?

1.首先，选取目的基因序列，对格式没有什么要求，只需要将目的基因序列复制就可以。 2.打开File目录下的New，选择Sequence。这里的另一个Project选项是导入文件的方式，也就是将目的基因以文件形式保存的可以直接导入文件。一般通过复制的方式会更方便。 3.打开Sequence后，会弹出粘贴框，只需要将刚刚复制的基因序列粘贴上即可，然后点击下方的Add。 4.选择上方的红蓝双向箭头的按钮进行引物设计，在设计开始前可以更改设计的参数，包括搜索的碱基范围、引物的长度，碱基数，设计结果显示的引物对数等。 5.设置完参数后，点击下方的Search，软件开始分析设计，完成后，点击OK。设计结果就会在下面显示出来。 6.结果中蓝色为前引物，红色为后引物，Rating是对引物的综合评价分数，在上方也会显示引物的优劣，最好的为Best，中等为Good，最次的为Poor。一般选择引物都为Best或Good，其它显示均是无法使用的。 7.在右边还有两个选项，All Primers可以查看可选择的多对不同引物。可以根据需要选择合适位置和适当产物长度的引物。选择后需要点击下方的Replace才能替换。 8.All Structers则可以查看当前选定引物的结构，如发夹结构，引物二聚体和重复碱基等。 9.引物选定完成后，点击下方的引物序列，再右键会弹出复制信息选项，进而将设计好的引物导出。也可以直接以文件的形式将结果导出。

pcr反应反应引物设计原则是什么?

. 引物最好在模板cDNA的保守区内设计。 2. 引物长度一般在15~30碱基之间。 3. 引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。 4. 引物3′端要避开密码子的第3位。 5. 引物3′端不能选择A，最好选择T。 6. 碱基要随机分布。 7. 引物自身及引物之间不应存在互补序列。 8. 引物5′端和中间△G值应该相对较高，而3′端△G值较低。 9. 引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。 10. 扩增产物的单链不能形成二级结构。11. 引物应具有特异性。

PCR引物设计原则PCR是目前研究DNA、RNA等核酸的非常有效和最主要的方法之一。它的原则主要是在模板cDNA的传统区域内设计方案、引物长短一般在15~30碱基中间、引物GC成分在40%~60%中间，Tm 值最好是贴近72℃、引物3′端要绕开密码子的第3位、引物3′端不可以挑选A，最好是挑选T等等。 首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配) ，再次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构。